酸性蛋白酶高产菌株的筛选及产酶条件研究

酸性蛋白酶高产菌株的筛选及产酶条件研究(含选题审批表,任务书,开题报告,中期检查表,毕业论文10000字)
摘  要：从土壤中筛选得到了产酸性蛋白酶较高的菌株。以发酵基本培养基为基础，研究了碳源、氮源、pH、种龄、接种量、温度和时间对酸性蛋白酶发酵菌株产酶的影响。结果表明在酸性蛋白酶的最适产生条件：2%玉米粉为碳源、2.5%豆粕粉为氮源，发酵初始pH 6.0，种龄12 h，接种量为3%，温度为32 ℃，时间为48 h下，蛋白酶活达到最高值，17.15 IU／mL。
关键词：酸性蛋白酶；筛选；液态发酵

Studies on the Screening of the Acid Protease Overproducting Strain and the Conditions of the Enzyme Production
Abstract：The acid protease overproducting strains was derived from soil.On the basic of fermentation medium, it was studied that the influence of the carbon and nitrogen sources, pH, inoculum size, fermentation temperature and time on the acid protease production by the strain. The results showed that the maximum acid protease activity could reach 17.15 IU/mL on the condition of 2% corn flour as carbon source, 2.5% soy bean meal as nitrogen source , initial pH 6.0, 12 h of seed age ,3% inoculum, 32 ℃,60 h of time.

Key words：Acid protease；Screen；Liquid fermentation

主要内容和要求：
 蛋白酶是一类使肽键断裂的水解酶,用途广泛,种类繁多,是主要的工业化酶制剂品种之一,主要用于饲料、皮革、医药和酿造工业,其产量约占整个酶制剂产量的60%[1～2]。根据蛋白酶的活性中心和作用的最适pH值,可将其分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。酸性蛋白酶是一类最适作用pH为2～4的蛋白酶类[3],主要来源于动物的器脏(胃蛋白酶等)和微生物分泌产生[4]。酸性蛋白酶是微生物分泌到胞外的能在pH值酸性环境范围内水解蛋白质的酶类，利用此机制以干酪素为底物，根据水解透明圈与菌落比值大小进行产酸性蛋白酶菌株的筛选，并对该菌株进行产酶条件优化。
主要内容：
1 材料
1．1 菌种：本试验采食堂出水口附近土样,筛选得到产酸性蛋白酶酶活较高的菌株。
1．2 培养基
(1)牛肉膏蛋白胨培养基 ：牛肉膏0.3%，蛋白胨1.0%，NaCl0.5%,琼脂2.0%
(2)干酪素培养基 ：2%酪蛋白，琼脂2.0%，pH 5.7，112 ℃灭菌15 min。。
(3)发酵培养基：可溶性淀粉1％、蛋白胨0．5％、Na2HP04•12H20  0．4％ 、KH2P04 0．03％ 、CaCl2  0.1％ 、pH 5.7、121℃灭菌25 min。

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2 主要仪器与设备
恒温振荡培养箱、超净工作台、恒温水浴锅、pHS-3C型数字型精密pH计、分光光度计、IX)4—2A医用离心机等。
3 方法
3．1 菌种的分离纯化与筛选：从土壤中采集样品，通过常规稀释平板法 ，以pH 5.7、2%干酪素培养基做鉴别培养基，根据单菌落透明圈直径与菌落直径比值(H／C)大小进行初筛，从中选取蛋白酶活力相对较高的进行摇瓶复筛。
3．2 培养条件
(1)活化条件：取一环菌种划线接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，30℃培养48 h
(2)发酵条件：接一环已活化的菌种于100 mL灭菌发酵培养基,30 ℃，180 r／min摇床培养48 h
3．3菌种鉴定
通过革兰氏染色法，在油镜下观察，鉴定产酶活力最高菌株的种类、形态和颜色。
3．3最佳发酵条件研究
(1)最佳C源确定：将发酵培养基中1％ 可溶性淀粉分别替换成1％的大米粉，蔗糖、玉米粉、麸皮、葡萄糖、淀粉其他成分不变，121℃灭菌25 min。接种后发酵48h，测定酶活。分析不同碳源对发酵的影响。
(2)最佳C源浓度确定：将以确定好的碳源分别以不同浓度配置成培养基（0.5、1、1.5、2、2.5、3%），，121℃灭菌30 min。接种后发酵48h，测定酶活。分析不同碳源浓度对发酵的影响。
(3)最佳N源确定：将发酵培养基中0.5％蛋白胨分别替换成0．5％的NH4SO4、牛肉膏、酵母膏、鱼粉、蛋白胨、豆饼粉，碳源为已确定碳源，121 ℃灭菌25 min。接种后发酵48h，测定酶活。分析不同氮源对发酵的影响。
(4)最佳N源浓度确定：将以确定好的氮源分别以不同浓度配置成培养基（0.5、1、1.5、2、2.5、3%），121℃灭菌25 min。接种后发酵48h，测定酶活，分析不同碳源浓度对发酵的影响。
(5)起始pH对产酶的影响：分别准确配置不同pH值（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）的培养基（其他按照已确定指标），121 ℃灭菌25 min。接种后发酵48h，测定酶活，分析不同pH度对发酵的影响。
(6)温度对产酶的影响：按照已确定培养基成分配置培养基，设定不同的培养温度（28℃，30 ℃，32℃，35 ℃，37℃，40℃），5%的接种量，培养48 h，测定酶活，分析不同温度对产酶的影响。
(7) 种子液菌龄对产酶的影响：设定不同的种子培养时间，分析种子不同菌龄对产酶的影响
(8) 接种量对产酶的影响：设定不同的接种量（1%、3%、5%、7%、9%、11%），测定酶活。
(9)发酵时间对产酶的影响：设定不同的发酵时间，测定酶活，分析不同发酵时间对产酶的影响。
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目  录
摘要…………………………………………………………………………………………1
关键词………………………………………………………………………………………1
1前言…………………………………………………………………………………………1

2材料与方法…………………………………………………………………………………3
    2.1  实验材料…………………………………………………………………………3
2.1.1 菌种………………………………………………………………………… 3
    2.1.2 培养基……………………………………………………………………… 3 [版权所有：http://think58.com]
    2.1.3 试剂………………………………………………………………………… 3
    2.1.4 仪器………………………………………………………………………… 4
2.2  实验方法…………………………………………………………………………4
    2.2.1  菌种的分离纯化与筛选 ………………………………………………… 4
    2.2.2  发酵培养 ………………………………………………………………… 5

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2.2.3  酪氨酸标准曲线的绘制 ………………………………………………… 5
    2.2.4  酸性蛋白酶粗酶液制备 ………………………………………………… 5
    2.2.5  酸性蛋白酶活力测定 …………………………………………………… 5
    2.2.6  样品酶活力的测定 ……………………………………………………… 6
    2.2.7  最适碳源的确定 ………………………………………………………… 6

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    2.2.8  最适碳源浓度的确定 …………………………………………………… 6
    2.2.9  最适氮源的确定……………………………………………… ………… 6
2.2.10 最适氮源浓度的确定………………………………… ………………… 6
    2.2.11 适宜培养基初始pH值的确定……………………………………………6
    2.2.12 最佳接种量的确定 …………………………………………………… …6

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    2.2.13 最适培养温度的确定 …………………………………………………… 7
    2.2.14 适宜培养时间的确定 …………………………………………………… 7
    2.2.15 发酵条件的正交优化试验设计 ………………………………………… 7
3  结果与分析……………………………………………………………………………… 7
3.1 酪蛋白标准曲线结果 ……………………………………………………………… 7 [资料来源：http://www.THINK58.com]
3.2 蛋白酶产生菌的分离筛选 ………………………………………………………… 8
3.3 不同碳源对酸性蛋白酶酶活力的影响 …………………………………………… 8
3.4 最适碳源浓度对酸性蛋白酶酶活力的影响 ……………………………………… 9
3.5 不同氮源对产酶的影响 ……………………………………………………………10
3.6 最适氮源浓度对酶活力的影响 ……………………………………………………10
3.7 初始pH值对酶活力的影响…………………………………………………………11 [来源：http://think58.com]
3.8 种子液菌龄对产酶的影响 …………………………………………………………11
3.9 不同接种量对产酶的影响 …………………………………………………………12
3.10最适培养温度的确定………………………………………………………………12
3.11宜培养时间的确定…………………………………………………………………12
3.12正交试验结果………………………………………………………………………13

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3.13最佳条件结果验证…………………………………………………………………14
4 讨论………………………………………………………………………………………14
5结论…………………………………………………………………………………14
6展望………………………………………………………………………………………14 [资料来源：http://THINK58.com]
参考文献 …………………………………………………………………………………15
致谢…………………………………………………………………………………………16
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